Nefrotoxicidad inducida por metotrexato: alteraciones hidroelectrolíticas y potenciales biomarcadores diagnósticos

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dc.contributor.advisor Torres, Adriana Mónica
dc.creator Severin, María Julia
dc.date.accessioned 2021-09-23T23:01:01Z
dc.date.available 2021-09-23T23:01:01Z
dc.date.issued 2019
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/2133/22166
dc.description.abstract El metotrexato es un antimetabolito, que aún introducido en la década del ́50, continúa siendo empleado en el manejo de ciertos tipos de cáncer y de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, a pesar de su diversificada aplicación y efectividad, produce efectos adversos en muchos órganos, incluyendo al riñón. Hasta la fecha se ha descripto que el principal mecanismo de nefrotoxicidad del metotrexato involucra la precipitación y deposición de sus cristales en los túbulos renales, pudiendo ocasionar obstrucción tubular. Además, se ha reportado que produce toxicidad tubular directa e hipoperfusión renal. No obstante, no se han descripto en detalle las alteraciones funcionales específicas que causa dicho fármaco a lo largo de la nefrona. En vista de lo previamente dicho se ha propuesto en una primera etapa, de este trabajo de tesis, el adquirir nuevos conocimientos de los efectos del metotrexato sobre la función renal, con el fin de poder esclarecer los mecanismos de nefrotoxicidad subyacentes y poder encontrar nuevos blancos terapéuticos frente a la misma. Por otro lado, los marcadores que tradicionalmente se emplean para diagnosticar a la lesión renal aguda (LRA) inducida por metotrexato, tales como los niveles plasmáticos de urea y de creatinina, resultan poco sensibles y específicos, y sus valores se encuentran alterados recién cuando el daño renal se encuentra instaurado. A consecuencia de esto, surge la necesidad de hallar nuevos biomarcadores de daño que permitan realizar un diagnóstico más temprano de la patología y así permitir intervenciones terapéuticas pertinentes. El transportador de aniones orgánicos 5 (Oat5) se expresa exclusivamente en riñón en la membrana apical de las células de los túbulos proximales. Nuestro grupo de trabajo ha sido pionero en la detección de Oat5 en orina. A raíz de ello, posteriores estudios demostraron que la excreción urinaria de Oat5 podría ser considerada como un novedoso biomarcador temprano de daño renal en modelos de LRA isquémica, nefrotóxica o de origen no renal. Es por ello por lo que una segunda etapa, de este trabajo de tesis, se abocó a la evaluación de la excreción urinaria y la expresión renal de Oat5 y a su potencialidad como biomarcador de daño renal inducido por metotrexato, así como también, al estudio del mecanismo de excreción urinaria de dicha proteína. Para cumplir con los objetivos propuestos, se procedió en primer lugar a realizar un estudio dosis-respuesta. Ratas Wistar macho adultas se trataron con cinco dosis diferentes de metotrexato (40, 80, 120, 180 y 360 mg/kg de p.c.). Luego de 2 días se obtuvieron diversos parámetros de función renal y se analizó la morfología del riñón. Además, se determinaron las abundancias en tejido renal y en orina de dos proteínas relevantes relacionadas con la homeostasis del agua (acuaporina 2, Aqp2) y de los electrolitos (cotransportador Na+-K+-2Cl-, Nkcc2) a lo largo de la nefrona. Los estudios dosis-respuesta en la respuesta renal al tratamiento con metotrexato, corroboraron las alteraciones reportadas en la bibliografía, tanto a nivel funcional como morfológico. Por otro lado, se indagó en nuevas modificaciones que no habían sido descriptas hasta el momento. Se observó que, el aumento del flujo urinario y de las excreciones fraccionales de agua, osmoles y electrolitos (sodio, potasio y cloruro), manifestadas a la mayor dosis empleada, se deberían al gran efecto tubulotóxico del metotrexato y en menor proporción a la modulación de proteínas renales; la disminución en la reabsorción de electrolitos a nivel del asa de Henle, debida en parte el aumento de la expresión de Nkcc2, conllevaría a una diuresis osmótica independiente de los niveles de Aqp2 a nivel distal. Posteriormente, para los estudios tiempo-respuesta, los animales recibieron una única dosis de metotrexato de 80 mg/kg p.c., y los estudios se llevaron a cabo a los 2, 4, 8 o 14 días postratamiento. Tal y como se realizó para los estudios dosis-respuesta, en esta etapa se obtuvieron diversos parámetros de función renal, se analizó la morfología del riñón y se determinaron las abundancias proteicas de Aqp2 y de Nkcc2. Los resultados demostraron que el metotrexato produjo alteraciones en la reabsorción de agua que pueden explicarse, al menos en parte, por un aumento en la expresión renal de Aqp2 al segundo día de haberse administrado el fármaco. Además, este antimetabolito produjo un incremento en la reabsorción de sodio y cloruro, a través de la mayor expresión renal de Nkcc2 a los 4 días postratamiento. En este punto de tiempo, se observó una elevada excreción de potasio que podría deberse a un aumento en la secreción de aldosterona. Por otro lado, el análisis de las excreciones urinarias de Aqp2 y de Nkcc2 permitió afirmar que podrían ser de utilidad dentro de un panel de biomarcadores para diagnosticar la nefrotoxicidad inducida por metotrexato. En conclusión, tanto para los estudios en función de la dosis (Capítulo I) como para los estudios en función del tiempo (Capítulo II), se demostró que el metotrexato produce efectos tóxicos en el manejo renal del agua y de los electrolitos, que estarían mediados en parte, por alteraciones en la expresión en membrana de las proteínas Aqp2 y Nkcc2. Luego, en estudios dosis-respuesta y tiempo-respuesta se analizaron la excreción urinaria de Oat5, su expresión renal y su contenido en diferentes fracciones de la orina, a fin de evaluar a la vía exosomal como mecanismo posible de su excreción urinaria. Por un lado, la excreción urinaria de Oat5 aumentó de manera dosis-dependiente de metotrexato. Además, se incrementó a una dosis del antifolato de 80 mg/kg p.c., i.p. 2 días luego de su administración, cuando aún no se evidenciaban alteraciones en los parámetros tradicionales de daño renal, manifestadas a mayores dosis de tratamiento. Por otro lado, el comportamiento de la excreción urinaria de Oat5 analizada en el tiempo luego de la administración del metotrexato, mostró que los niveles de Oat5 en orina aumentaron a los 2 días de tratamiento, antes de que se observaran alteraciones en parámetros tradicionales indicadores de daño renal. Estos resultados permitieron proponer a la excreción urinaria de Oat5 como un posible biomarcador temprano no invasivo de la lesión renal inducida por metotrexato. Además, postularla como biomarcador potencial para controlar la evolución temporal del daño renal con el fin de intervenir el tratamiento farmacológico y de prevenir el desarrollo de toxicidades asociadas a una menor eliminación del metotrexato. La excreción urinaria de Oat5 podría utilizarse, ante un cuadro de nefrotoxicidad inducido por este fármaco, como indicador de la presencia de daño renal cuando todavía no existe un compromiso de la integridad funcional y estructural del tejido renal. Posteriormente, con el objetivo de caracterizar el mecanismo de excreción urinaria de Oat5, y analizar su sensibilidad analítica, también se evaluó la abundancia de Oat5 en exosomas urinarios, en la fracción de sedimento y en el sobrenadante remanente de la obtención de los exosomas, para ser comparados con la abundancia de Oat5 en la orina total. Los resultados mostraron que el mecanismo de excreción urinaria de Oat5 dependería del grado de lesión inducido por metotrexato: en ausencia de alteraciones en parámetros tradicionales de función renal (valores de urea similares al grupo Control), se observó un incremento selectivo de Oat5 en exosomas urinarios. Para este nivel de daño, los exosomas serían una fuente óptima para la detección de este biomarcador temprano. Cuando se instauró la disfunción renal, evidenciada por un incremento en la urea plasmática, entre otros marcadores, Oat5 apareció soluble en la orina en detrimento de su fracción exosomal. A su vez, su excreción urinaria se condijo con menor expresión en tejido renal. El elevado daño celular inducido por metotrexato alteraría los mecanismos de señalización intracelular involucrados en la formación de exosomas. Cabe remarcar que, aun así, la orina total sería una fuente más sensible para detectar a Oat5 respecto de sus fracciones, mediante la técnica utilizada en este trabajo (Western blotting). En resumen, tanto para los estudios en función de la dosis como para los estudios en función del tiempo, se demostró que la excreción urinaria de Oat5 sería un buen biomarcador temprano de daño renal inducido por metotrexato y que su mecanismo de aparición en orina dependería del daño celular ocasionado por dicho agente (Capitulo III). Como conclusión de este trabajo de tesis, es posible afirmar que el metotrexato ocasiona disturbios en el manejo renal de agua y de electrolitos, en parte, mediante alteraciones en la expresión de Aqp2 y de Nkcc2 en el riñón. Por otro lado, la disminución en la excreción urinaria de Aqp2 junto a un aumento de Nkcc2 y de Oat5 en la orina, después de dos días de la administración de metotrexato, podría considerarse como un excelente panel de biomarcadores para la detección temprana de la nefrotoxicidad inducida por metotrexato, debido a que los parámetros tradicionales de la función renal, como la uremia y el aclaramiento de creatinina, no se modifican en este momento. Este trabajo de tesis resulta novedoso en términos de contribución al conocimiento de las bases subyacentes a la nefrotoxicidad inducida por metotrexato. A su vez, otorga fundamentos para proponer nuevos biomarcadores de esta patología con el objetivo de su diagnóstico temprano para dar lugar a una intervención oportuna. es
dc.format application/octet-stream
dc.language.iso spa es
dc.rights embargoedAccess es
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ *
dc.subject Metotrexato es
dc.subject Nefrotoxicidad es
dc.subject Biomarcadores es
dc.title Nefrotoxicidad inducida por metotrexato: alteraciones hidroelectrolíticas y potenciales biomarcadores diagnósticos es
dc.type doctoralThesis
dc.type Tésis de Doctorado
dc.type acceptedVersion
dc.rights.holder Severin, María Julia es
dc.rights.holder Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas es
dc.rights.text Atribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentina es
dc.description.fil Fil: Severin, María Julia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Área Farmacología; Argentina. es
dc.type.collection tesis
dc.type.other doctoralThesis es
dc.type.version acceptedVersion es


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